基于滚换扩增反应的DNA纳米结构的制备及其在载药方面的应用研究

THERAPEUTIC DNA NANO-SYSTEM FABRICATED FROM ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION

赵浩然

11649115

硕士

空间材料与加工

田雷蕾

2018-06-01

2018-07-05

哈尔滨工业大学

深圳

化疗一直是治疗癌症的主流方法，然而显著的副作用是化疗的致命弱点，这是由于抗癌药物也能以非选择性的方式攻击正常细胞。癌症靶向递送化疗药物到实体瘤是解决问题的有效方法。近年来，DNA 纳米生物技术由于其独特的生物相容性，精确的多功能识别能力以及敏感的刺激反应性等特点，在开发新的化学传递系统方面发挥了重要作用。表现出癌症靶向或癌症-微环境触发响应性的功能性核酸（FNA）已被广泛研究。DNA 适配体是人工合成的寡核苷酸配体，可以以高亲和力和特异性结合到多种靶标上。针对癌症相关靶标开发的适体如肿瘤细胞膜蛋白已成为肿瘤追踪和治疗的有力工具。此外，药物释放的过程可以通过由癌症微环境触发的 DNA 构象转换如 pH、温度、氧化还原和生物分子来很好地控制。因此，大量的化疗系统与 FNAs 整合，以实现有针对性的药物递送和释放。其中，由于纯 DNA 纳米结构在结构可编程性、功能丰富性、生物相容性方面具有无可比拟的优势，因而受到越来越多的关注。例如，折纸技术制造的 DNA 纳米结构，其结构和功能最为可控，已经应用于生物医学领域。同时 DNA 纳米结构在化学药物输送应用方面也面临一些挑战，例如细胞内和生物体内稳定性差，复杂的制备工艺，以及大量寡核苷酸的高成本。其在含血清培养基中的低稳定性是最主要的问题，可以通过减少 DNA 上的切口位点，增加 DNA 缩合密度或外部包覆来解决。DNA 分子从伸展态到紧缩态的构象转变被称为 DNA 缩合（condensation）。在病毒和真核细胞的细胞核内，高度缩合且有序排列的 DNA 结构保持了基因的稳定性，保证了遗传信息的保存及传递。DNA 缩合不仅是一种自然现象，也是被广泛应用于基因转染和 DNA 提取技术。DNA 缩合制备的纳米粒子具有极好的生物稳定性，且操作简单、制作成本低，但 DNA 缩合技术多用于基因转染 缺 乏 功 能 性 的 拓 展 。 最 近 一 种 基 于 恒 温 滚 环 扩 增 反 应 (rolling circle amplification, RCA)反应产物的 DNA 缩合纳米结构被发现，并迅速在纳米医药领域引起了人们的广泛研究兴趣。RCA 是一种恒温扩增反应，以环状 DNA/RNA为模板，在聚合酶的作用下通过链置换反复、持续地复制模板序列，是制备具有特定序列的高分子量 DNA/RNA 简单有效、成本低廉的方法。反应过程中会有大量的副产物焦磷酸镁（magnesium pyrophosphate）产生，RCA 产物，即具有特定序列的长单链 DNA 序列，在 MgPPi 的作用下发生缩合形成 RCA-MgPPi复合体系。这种微纳米结构具有非常好的生物稳定性、低的细胞毒性、及可设计的功能性。然而原位形成的 RCA-MgPPi 纳米结构存在着产量低、粒径大以及由于结构密实而导致的修饰困难等问题，限制了其在生物医学领域的广泛应用。在这里，我们报告了一种新的方法来制造 RCA 产品的化疗纳米结构。我们根据前面发现的，过量的 Mg2+可以有效地缩合和保护 RCA 产物免受酶降解，利用过量的 Mg2+缩合 RCA 产物制备了~100 nm 的纳米粒子（在下面的部分将被称为 RCA-Mg）。尽管与其他高价阳离子如 Cd3+和 Al3+相比，Mg2+是一种相对较弱的缩合剂，但它是人体电解质之一，具有更好的生物相容性和更低的毒性。一方面，血液中 Mg2+的正常水平在 0.4-0.6 mM 左右，这足以保持 RCA-Mg纳米粒子的完整和稳定。另一方面，与 MgPPi 固定不同，DNA 与 Mg2+之间通过静电引力的动态相互作用将更好地保留 DNA 的功能，从而促进药物释放过程。最终我们利用 Mg2+缩合 RCA 产物的方法，制备了 RCA-Mg 纳米粒子，该纳米粒子表现出低毒性、生物稳定性高、大的 Dox 装载效率和酸性条件的缓释效果、以及癌细胞的靶向性好等诸多优点。随后的活体实验进一步证明了RCA-Mg@Dox 纳米复合体的靶向给药及缓释能力，很好地实现了抗癌药物在肿瘤区域的富集。由于这类 DNA 纳米粒子是基于 RCA 产物，其序列可通过设计实现更多的功能，因此这类纳米粒子在纳米医药应用领域显示出了广泛的潜力。

In recent years, DNA has been increasingly used as a structural unit in many fields such as biology and medical care. Recently, functional nucleic acid (FNA) provided a new chemical therapeutic method for the field of nanomedicine. By designing DNA sequences, a biocompatible nanosystem with high drug-loading capacity can be prepared with a stimuli response at the microenvironmental tumor site. The carrier systems which can load a large number of drugs, to a certain extent, can avoid many side effects of chemotherapy drugs in our body. However, at present, the high cost of DNA, the instability in the serum, and the complex manufacturing process are the major limitations of the development of DNA-based nano-drug delivery vehicles. In this paper, a rolling-circle amplification (RCA) technology was used to develop doxorubicin (Dox) drug-loaded nanoparticles for tumor-targeting chemotherapy. Through this technique, a large amount of functional DNA can beprepared simply and efficiently.In addition, as the main electrolyte, Mg2+ in human’s bodies has excellent biocompatibility, which can fully condense the long single-stranded DNA sequence generated by the RCA reaction, while its functionality can be also ensured. The DNA nanoparticles formed by the condensation of Mg2+ (Mg-RNC) exhibit relatively high biological stability, which can be considered as a safe and desirable nanomaterial for in vivo applications. Besides, Mg-RNCs also shows a slowly and sustainable release in pH 5.0 buffer which contains serum. In this paper, we fully demonstrate that this Mg2+ condensed multifunctional DNA nanoparticles can successfully target to tumor issues and release Dox via cell experiments and in vivo experiments by detecting capacity of targeting and Mg2+ dynamics.In summary, the new method of Mg2+ condensed DNA long single-stranded that produced by RCA reaction, can be used to prepare bio-friendly biomedical nanoparticles through relatively simple design and manufacturing processes. The stability of the structure and the versatility of DNA provides a new approach, which will show a huge and wide application potential in the biomedical field.

肿瘤治疗 靶向 药物释放 滚环扩增 DNA Mg2+

oncotherapy targeting drug delivery rolling circle amplification DNA Mg2+

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联合培养

南方科技大学

赵浩然. 基于滚换扩增反应的DNA纳米结构的制备及其在载药方面的应用研究[D]. 深圳. 哈尔滨工业大学,2018.