POTENTIAL ROLE OF DHX33 IN THE DEVELOPMENT OF HUMAN COLON CANCER

DHX33 在人类结肠癌中的潜在功能

朱亚菊

11649087

硕士

生物学

张严冬

2018-06-01

2018-07-05

哈尔滨工业大学

深圳

Colon cancer（CRC）is one of the most common malignancies in the world. Every year colon cancer-related death rate remains high, but there is no effective therapeutic treatment for it up to now. Our previous studies provided evidence that RNA helicase DHX33 is a major regulator in cell proliferation and growth. It was found to be highly expressed in several human cancers. However, it remains unknown whether DHX33 plays a role in colon cancers, if it does, what would be the exact role of DHX33 in colon cancer? In this study, DHX33 was knocked down in HCT116 and LOVO cells by lentiviral delivery of shRNAs. Western blotand Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) were performed to detect the expression levels of a set of critical genes involved in cell cycle, apoptosis and cell migration. Additionally, cell proliferation assay, cell colony formation assay, cell apoptosis analysis were performed to elucidate the role of DHX33 in CRC development and progression. Our findings strongly suggest that DHX33 is highly expressed in colon cancer tissues and colon cancer cell lines; knockdown of DHX33 significantly decreased cell proliferation and promoted cell apoptosis. Mechanistically, DHX33 transcriptionally controls critical genes involved in cell cycle, apoptosis and migration. Importantly, DHX33 deficiency inhibited tumor growth of colon cancer cells in a xenograft model in vivo.Deregulation of the Wnt/β-catenin signaling is frequently detected in colon cancer. To investigate the molecular mechanism for DHX33 regulation in colon cancer, we used Wnt/β-catenin activator, recombinant human Wnt3a protein, and Wnt inhibitor, DKK1, to treat HCT116 cells. We also used LiCl to perturb Wnt signaling in this system, and then analyzed DHX33 expression. Our findings suggest that DHX33 and Wnt/β-catenin signaling pathway have reciprocal regulation. In addition, GSK3β might directly regulate DHX33 in a Wnt independent manner.This study for the first time demonstrates the role of DHX33 in colon cancer and the underlying molecular mechanism. We also provide the initial report for the relationship between DHX33 and Wnt/β-catenin signaling pathway as well as DHX33 and GSK3β in colon cancers. This may provide new therapeutic target for treating colon cancer. Our findings may shed light on a novel way for the treatment of colon cancers.

结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，每年有很多人死于结肠癌。结肠癌多发于男性和老年人群中。大部分结肠癌的病发与不良的生活及饮食习惯有关，如饮食不规律，高脂肪低纤维食物的摄入，吸烟，酗酒等。还有一部分与遗传相关。在美国，结肠癌近五年的存活率为 64.9%，相比过去十年已有所提高。目前结肠癌的治疗手段以手术疗法为主，随着科研水平的不断提高，医疗技术的不断改善及相关治疗药物的研发，结肠癌治愈的成功率大大提高。然而，由于结肠癌前期症状易与其他胃肠类疾病混淆从而被人忽略且预后性差，拥有极高的复发率，故目前仍然缺乏针对它的有效治疗措施。因此进一步探索结肠癌发病的分子机制，寻找新的治疗靶点或者设计新的治疗药物对于治疗结肠癌刻不容缓。我们先前的研究成果表明 DHX33 是一类高度保守的 DEAD/DEAH RNA 解旋酶.在哺乳动物体内参与诸多生物学进程，例如核糖体的合成，RNA 的转录及剪切，蛋白质的翻译等。在我们之前的研究成果中表明 DHX33 是细胞增殖和生长的重要调节因子，并且它在多种人类癌症中存在高效表达的现象，例如人类非小细胞肺癌，乳腺癌等。然而，它是否同样参与结肠癌的发生、发展以及它在结肠癌中的潜在功能及作用的分子机制目前还尚不清楚。为解答我们的疑问，探索 DHX33 在人类结肠癌发生发展中潜在的功能，本研究首先采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC）利用 DHX33 抗原抗体结合的高度特异性检测在结肠癌组织，淋巴转移组织，邻近正常组织及正常组织内DHX33 的表达量是否存在显著性差异。然后利Western blot 和实时定量聚合酶链反应（RT PCR）检测在正常结肠细胞系 FHC，结肠癌细胞系 HCT116 和LOVO 细胞系内 DHX33 表达的差异性。从而发现在在结肠癌组织、淋巴转移组织及结肠癌细胞系内 DHX33 均存在过量表达的现象。随后我们采用两种不同的编码 shRNA 的重组慢病毒颗粒转染人结肠癌细胞 HCT116 和 LOVO 从而沉默 DHX33 的表达，并且以 shScramble 作为阴性对照。 然后用 Western blot和实时定量聚合酶链反应（RT PCR）分别检测细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移相关基因在 mRNA 和蛋白质表达水平发生的变化，进一步探索 DHX33 在结肠癌细胞内的作用机制。研究结果表明 DHX33 的敲低会减少下游 CdCs, McMs, MMPs, E2F1,Bcl-2 基因的转录及蛋白质的表达，同时增加促凋亡基因 Bad 的转录和蛋白表达。另外，通过细胞增殖、细胞独立锚定、细胞群形成及细胞凋亡等实验进一步验证在结肠癌细胞系内 DHX33 的敲低对癌细胞恶性表型的影响，从而阐明 DHX33 在结直肠癌发生发展中的具体作用。我们的研究结果表明：DHX33 在结肠癌组织和结肠癌细胞系内均过量表达，且 DHX33 的敲低可显著抑制结肠癌细胞的增殖和生长，使结肠癌细胞丧失诸多的恶性表型并促进结肠癌细胞的凋亡，免疫缺陷小鼠的异体成瘤实验进一步表明 DHX33 敲低可以抑制结肠癌细胞在体内的肿瘤形成和生长。Wnt /β-catenin 信号通路是生物体内一条高度保守的信号通路，参与诸多生物学进程， 譬如胚胎发育，细胞增殖和分化，细胞代谢等。由于 Wnt /β-catenin信号通路的多功能性，所以 Wnt /β-catenin 信号通路已成为近几年生物学研究的一大热点。近年来，诸多研究表明：在结肠癌中 Wnt /β-catenin 信号通路调节是异常的。所以我们大胆提出猜测：在结肠癌内 DHX33 的过量表达是否也与 Wnt /β-catenin 信号通路存在某些不为人知的关联。Wnt3a 作为经典的 Wnt信号激活剂可以通过与细胞膜表明的受体相结合激活 Wnt /β-catenin 信号通路；DKK1 作为经典的 Wnt 信号抑制剂可以通过与细胞膜表明的 Wnt 受体竞争性结合从而抑制 Wnt /β-catenin 信号通路。所以为进一步探讨 DHX33 在结肠癌中的作用是否与 Wnt /β-catenin 信号通路的调节有关，我们首先采用 Western blot 和实时定量聚合酶链反应（RT PCR）分别检测了在结肠癌细胞系 HCT116 和 LOVO内 Beta-Catenin 是否也存在过量表达的现象。结果表明在结肠癌细胞系内Beta-Catenin 亦存在过量表达的现象。然后我们采用两种不同的编码 shRNA 的重组慢病毒颗粒转染人结肠癌细胞 HCT116 从而沉默 DHX33 的表达，并且以shScramble 作为阴性对照。72 小时后收集细胞采用 Western blot 检测了在结肠癌细胞系 HCT116 内 β-catenin 环链蛋白、DHX33 和磷酸化 GSK3β 表达量的变化，结果表明 DHX33 的敲低可显著降低细胞内 Beta-Catenin 的水平。Wnt3a作为经典的 Wnt 信号激活剂可以通过与细胞膜表明的受体相结合激活 Wnt /β-catenin 信号通路；DKK1 作为经典的 Wnt 信号抑制剂可以通过与细胞膜表明的 Wnt 受体竞争性结合从而抑制 Wnt /β-catenin 信号通路。为进一步验证实验结果，我们分别使用 Wnt /β-catenin 信号通路激活剂和抑制剂：重组人类 Wnt3a蛋白及重组人类 DKK1，在一定浓度下（重组人类 Wnt3a：150ng/ml；重组人类 DKK1：200ng/ml）处理 HCT116 细胞 72 h, 然后收获细胞，采用 Western blot和实时定量聚合酶链反应（RT PCR）检测分别用 Wnt3a、Dkk1 处理组及阴性对照组内 DHX33，Beta-Catenin 及 pGSK3-Beta 表达量在蛋白水平及 mRNA 水平的变化。实验结果表明利用 Wnt3a 处理 HCT116 细胞后会积累 Beta-Catenin 并且增加 DHX33 的表达，相反，利用 Dkk1 处理 HCT116 细胞后会减少Beta-Catenin 并且下调 DHX33 的表达。另外，我们为进一步验证两者间的关系，我们进行了 Beta-Catenin 的 Rescue 实验：首先我们利用 sh-DHX33 敲低 DHX33并以 shSCR 组作为阴性对照,72h 后添加 150ng/ml 的 Wnt3a 处理 48h 然后利用Western blot 和实时定量聚合酶链反应（RT PCR）检测在 shSCR 组，shSCR 加Wnt3a 组，sh-DHX33 组及 sh-DHX33 加 Wnt3a 组四组细胞样品内 β-catenin 环链蛋白、DHX33 和磷酸化 GSK3β 表达量的变化，并对四组细胞进行为期 6 天的生长曲线绘制。结果表明 DHX33 对 Beta-Catenin 的调节作用在结肠癌细胞内至关重要，DHX33 存在时，Wnt3a 可显著激活 Beta-Catenin，从而上调 DHX33，促进细胞增殖；而敲低 DHX33 对结肠癌细胞增殖引起的抑制作用利用 Wnt3a激活 Beta-Catenin 几乎无法回复。氯化锂作为经典 Wnt 信号通路的激活剂，在正常细胞及组织内主要通过直接抑制 GSK3-Beta 的活性解体 GSK3-Beta 与 APC 及 Axin 组成的 Beta-Catenin降解三元复合物从而引起 Beta-Catenin 的积累激活 Wnt /β-catenin 信号通路。有研究表明在癌组织及癌细胞内，氯化锂具有激活或抑制 Wnt /β-catenin 信号通路的双重作用。同时，有研究表明氯化锂引起的 GSK3-Beta 活性的抑制在部分癌症中也可能引起严重的细胞凋亡。本课题研究中，我们也使用氯化锂干扰GSK-3活性介导的 Beta-Catenin 水平的变化来分析 Wnt /β-catenin 信号通路对DHX33 的调控作用。首先，我们采用低浓度氯化锂（1mM）处理 HCT116 细胞24h,然后采用 Western blot 和 RT PCR 分别检测 β-catenin 环链蛋白、DHX33 和磷酸化 GSK3β 表达水平的变化。 结果表明低浓度的 氯化锂通过过表达GSK3-Beta 从而减少 Beta-Catenin 的表达，抑制 Wnt /β-catenin 信号通路，但此时 DHX33 却明显上调，与前面叙述的实验结果相矛盾，所以我们猜测，是否GSK3-Beta 同 样 参 与 DHX33 的调节。于是我们采用高浓度的 氯化锂（10mM,20mM）分别处理处理 HCT116 细胞 4h, 48h,72h.然后采用 Western blot和 RT PCR 分别检测 β-catenin 环链蛋白、DHX33 和磷酸化 GSK3β 表达水平的变化。结果表明高浓度的氯化锂在短时间内抑制 Beta-Catenin 的表达，抑制 Wnt /β-catenin 信号通路，上调 DHX33，随着时间的延长，通过抑制GSK3-Beta 的激活从而积累大量 Beta-Catenin，激活 Wnt /β-catenin 信号通路引起下游部分细胞周期，迁移相关基因的上调，但此时 DHX33 的表达却明显被抑制，且促凋亡相关基因过表达抑凋亡基因明显下调。引起严重的细胞凋亡。一系列研究结果表明：Wnt 信号通路参与结肠癌细胞内 DHX33 表达的调控，同时 DHX33 也可通过调节 Wnt /β-catenin 信号通路在结肠癌的发生发展中发挥作用，二者具有相互调控的关系。且在结肠癌细胞系内，GSK3-Beta 可能对 DHX33 的表达也具有调节作用，而且这种调节作用与 Beta-Catenin 同时存在时，可能占据主导地位。在本课题研究中，依然有很多待解决的问题存在，为进一步探究 DHX33，Beta-Catenin 及 GSK3-Beta 间准确的调控关系，接下来我们会采用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），凝胶迁移实验（EMSA)和染色质免疫共沉淀技术（CHIP）分析它们是否直接结合并识别其可能存在的结合位点，然后将 DHX33启动子克隆到荧光素酶报告分子（luciferase reporter）结构中去分析它们之间的转录调控关系。本课题首次创造性的提出对 DHX33 在结肠癌发生发展过程中功能及作用机制进行探索性研究。揭示了 DHX33 在人类结肠癌发生发展过程中的潜在功能及其分子机制。并且首次揭示了 DHX33 与 Wnt /β-catenin 信号通路及主要成分 GSK3β 在人类结肠癌发生发展过程中可能存在的复杂的相互调控关系。这一发现能够为结肠癌的治疗提供新的治疗靶点或者为结肠癌治疗的药物设计提供新的思路，给广大结肠癌患者的治疗带来新的福音。

DHX33 Wnt/β—Catenin GSK3β Wnt3a DKK1 LiCl Colon cancer

DHX33 Wnt/β—Catenin GSK3β Wnt3a DKK1 氯化锂 结肠癌

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Zhu YJ. POTENTIAL ROLE OF DHX33 IN THE DEVELOPMENT OF HUMAN COLON CANCER[D]. 深圳. 哈尔滨工业大学,2018.