胰岛素信号通路双稳态的实验验证

VERIFICATION OF BISTABLITY OF THE INSULIN SIGNALING PATHWAY

韩尚辰

11649091

硕士

生物学

王冠宇

2018-06-04

2018-07-01

哈尔滨工业大学

深圳

二 型 糖 尿 病 是 具 有 复 杂 多 因 素 病 因 的 一 类 严 重 威 胁 人 类 生 命 健康 的 慢 性 、非 传 染 性 疾 病 ，它 的 流 行 标 志 着 我 们 这 个 时 代 的 重 大 医 疗危机。2 型糖尿病以胰岛素抵抗为特征，并伴有高血糖、高血脂、高血 压 、动 脉 粥 样 硬 化 血 管 疾 病 等 症 状 。对 胰 岛 素 抵 抗 的 原 创 性 探 索 将为解决该危机带来希望。胰 岛 素 抵 抗 是 指 机 体 由 于 缺 乏 对 胰 岛 素 的 响 应 而 导 致 的 血 糖 摄取 困 难 ， 它 和 受 损 的 葡 萄 糖 代 谢 的 生 理 反 应 是 持 续 的 刺 激 胰 岛 素 分泌 ，并 引 发 胰 腺 β 细 胞 逐 渐 衰 退 ，最 终 导 致 2 型糖尿病及其急性和慢性 并 发 症 的 逐 渐 发 展 。与 作 为 2 型糖尿病的病理基础这一基本观点相悖 ，即 胰 岛 素 抵 抗 首 先 是 一 个 必 不 可 少 的 有 用 机 制 ，重 度 的 胰 岛 素 抵抗 在 特 定 条 件 下 也 是 必 要 的 。本 文 基 于 以 细 胞 内 部 分 子 动 力 学 为 主 导作用的可调节性阈值假说，研究的重点聚焦于胰岛素抵抗这一基本现象 ，选 用 三 种 在 胰 岛 素 反 应 中 被 广 泛 运 用 的 细 胞 株 作 为 研 究 对 象 ：小鼠 来 源 C2C12 骨 骼 肌 细 胞 、 小 鼠 来 源 Hepa1-6 肝 癌 细 胞 和 人 来 源HepG2 肝 癌 细 胞 ，通 过 蛋 白 质 免 疫 印 迹 (Western blot)实验和免疫荧光能量共振转移技术 (Fluorescence resonance energy transfer， FRET)对胰 岛 素 信 号 通 络 双 稳 态 及 右 平 漂 门 限 假 说 进 行 验 证 ，结 果 如 下 ：蛋 白免疫印迹法研究细胞群体对胰岛素的响应结果表明 C2C12 肌肉细胞分化后得到的胰岛素响应曲线符合双稳曲线的 假 设 ；癌 变 细 胞 的 响 应曲线具有不可逆的特征， Akt 被激活后的一定时间内保持较高活性；当加入适量的 PI3K 激酶抑制剂时，C2C12 骨骼肌细胞和 Hepa1-6 肝癌细胞的胰岛素响应曲线发生了明显的右平漂；FRET 检测单细胞对胰岛素的响应表明 Hepa1-6 细胞门限 Ion 明显，HepG2 细胞在没有胰岛素存在的时候磷酸化 Akt 蛋 白 (p-Akt)就保持较高水平而且没有明显 的 阈 值 ，两 种 细 胞 Akt 蛋 白 磷 酸 化 后 ，即 使 在 没 有 胰 岛 素 存 在 的 情况下， p-Akt 也保持较高活性。综 上 所 述 ，正 常 细 胞 与 癌 变 细 胞 对 胰 岛 素 刺 激 的 响 应 基 本 符 合 可调 节 性 阈 值 假 说 ，细 胞 群 体 与 单 细 胞 的 验 证 确 凿 了 双 稳 响 应 曲 线 的 可靠性，为发现最佳的糖尿病治疗和干预的时期提供了新的思路。

Type 2 diabetes is a chronic and non -communicable disease that seriously threatens human life and health. It has a complex multifactorial etiology. Its prevalence marks a major medical crisis in our era. Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and is accompanied by hyperglycemia, hyperlipidemia, hypertension, and atherosclerotic vascular disease. The original exploration of insulin resistance will bring hope to solve this crisis.Insulin resistance refers to the difficulty of blood glucose intake due to lack of response to insulin, and its physiological response to impaired glucose metabolism is sustained stimulation of insulin secretion and triggers gradual decline of pancreatic beta cells, eventually leading to type 2 diabetes and its Progressive development of acute and chronic complications. Contrary to the basic idea of the pathological basis of type 2 diabetes, insulin resistance is first and foremost an essential and useful mechanism, and severe insulin resistance is also necessary under certain conditions. This article is based on the regulation threshold hypothesis that the internal molecular dynamics of cells is the leading role. The focus of the research is on the basic phenomenon of insulin resistance. Three cell lines that are widely used in insulin response were selected for research: Mouse sources C2C12 skeletal muscle cells, Hepa1 -6 hepatoma cells and human HepG2 hepatoma cells derived from HepG2 cells were detected by Western blot and Fluorescence resonance energy transfer (FRET) for insulin signaling. The steady-state and right-shifting threshold hypothesis were tested and the results were as follows: Western blot analysis of cell population response to insulin. The results showed that the insulin response curve after normal cell differentiation was consistent with the bi-stable curve hypothesis, and the response curve of cancer cells was irreversible. The characteristics of Akt activation after a certain period of time to maintain high activity; when adding the appropriate amount of PI3K kinase inhibitor, C2C12 skeletal muscle cells and Hepa1-6 hepatic cells insulin response curve showed a significant right-shift; FRET test single cell response to Insulin shows Hepa1-6 Ion cell threshold significantly, HepG2 cells maintain high levels of phosphorylated Akt (p -Akt) in the absence of insulin and have no clear threshold, after phosphorylation of both cellular Akt , p -Akt proteins maintained high activity even in the absence of insulin.In summary, the responses of normal cells and cancerous cells to insulin stimulation are basically in line with the regulation threshold hypothesis. The verification of cell populations and single cells confirmed the reliability of the bistable response curve in order to find the best treatment and intervention for diabetes.

胰岛素抵抗 胰岛素信号通路 迟滞逆转 双稳响应

Insulin resistance Insulin signaling pathway Hysteresis reversal Bistable response

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联合培养

南方科技大学

韩尚辰. 胰岛素信号通路双稳态的实验验证[D]. 深圳. 哈尔滨工业大学,2018.