AUTOPHAGY AND CALCIUM DYNAMICS

细胞自噬与钙离子震荡的研究

陈艳

11649183

硕士

生物工程

黄巍

2018-06-04

2018-07-07

哈尔滨工业大学

深圳

Autophagy is an intracellular catabolic process. It helps cells degrade damaged organelles, protein aggregates and long-lived proteins, thus ensuring the degradation and recycling of intracellular substances to maintain cellular homeostasis. Generally, autophagy helps cells survival by resisting disadvantageous conditions, such as oxidative stress, serum or nutritional deprivation. Dysfunctional autophagy is associated with many diseases such as cancers, neurodegenerative diseases and immune abnormalities. Calcium is a very important second messenger which participates in many signal pathways in cells. Therefore, the concentration of intracellular free calcium ions plays a very critical role in cell fate. Some studies have shown that intracellular calcium ion concentration is closely associated with autophagy. However, these works are only focused on the high and low concentrations of calcium ions on cell autophagy. Till now, the data of the mechanism for calcium regulation of autophagy is still quite controversial. We propose to quantitatively modulate the intracellular calcium concentration fluctuation with certain frequencies and amplitudes via optical control of intracellular calcium influx and examine the relation between the dynamic calcium oscillation and autophagy. In this study, we used Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A (MAP1LC3), a membrane protein of autophagosome, and calcium sensor R-GECO to quantitatively reflect autophagy and calcium dynamics. A light-activated channel G protein-coupled receptor, OPN4 was used to regulate intracellular calcium dynamics. Our study demonstrates that calcium influx inhibited autophagy in Hela cells.

细胞自噬是细胞内的一个分解代谢过程，它的发生过程是从内质网等细胞器提供的双层膜结构去构成双层膜包裹的小泡开始，并在双层膜形成小泡的过程中将需要降解的物质包进小泡中，完成包裹的小泡叫做自噬小体，自噬小体会与溶酶体结合，形成自噬溶酶体，之前吞进去的物质会被溶酶体中的酶降解掉，然后自噬溶酶体结构也会被降解，因此这一过程能在细胞的生命进程中帮助细胞清理细胞内衰老的细胞器、折叠错误的蛋白、侵入细胞的异物等。基于这一功能，正常的细胞自噬能帮助细胞在氧化压力、营养缺乏等不利条件下存活，而功能紊乱的细胞自噬则有可能会导致疾病的发生，一些研究中发现在癌症、神经退行性疾病中相应的病变细胞中的自噬也发生了紊乱。钙离子在细胞信号通路中是一个非常重要的第二信使。一般情况下，钙离子在细胞内的浓度由离子通道所控制，一些研究表明，钙离子浓度的变化与疾病发生相关，在细胞自噬的研究中， 有研究表明钙离子对细胞自噬具有调控作用，钙离子通过不同的途径调控相关通路的中间物能对细胞自噬进行抑制或是促进，而对于钙离子在细胞内浓度的增加和降低对细胞自噬是抑制还是促进依然存在争议。因此，我们的设想是钙离子浓度如果在细胞内以一定的频率震荡，这样动态变化的钙离子浓度对细胞自噬会有意想不到的结果。在本实验中，我们需要一个能反映细胞是否发生了自噬的探针，我们在实验中选择的是微管相关蛋白轻链 3（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A），即 LC3，LC3 蛋白由 MAP1LC3A 基因编码，能够调节微管与细胞骨架之间的相互作用，最主要的是 LC3 是细胞自噬的一个 marker，在细胞发生自噬的过程中，LC3 会由 LC3-Ⅰ转化成 LC3-Ⅱ，这一过程是通过在 LC3 的碳末端将谷氨酸磷酸化，磷酸化后的 LC3 将会转移到形成自噬小体的双层膜上，之后随着自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，这一过程 LC3 都全部参与。我们根据之前的研究，选择连接了绿色和红色荧光蛋白的 LC3（GFP-RFP-LC3）作为细胞自噬的探针，这三个蛋白线性的连接在一起表达之后得到一个融合蛋白，在这个融合蛋白中，红色荧光蛋白是一个酸稳定性蛋白，而绿色荧光蛋白是一个对酸性敏感的蛋白，当细胞发生自噬时，在自噬的最后一个阶段，自噬小体与溶酶体融合使得膜内侧的 GFP-RFP-LC3 蛋白处于酸性环境中，从而导致膜内侧的绿色荧光蛋白淬灭，因此在自噬溶酶体上的 GFP-RFP-LC3 融合蛋白中会只有红色荧光蛋白而没有绿色荧光蛋白。我们将 GFP-RFP-LC3 融合蛋白的序列敲入 Hela 细胞中，流式分选得到足够数量的单细胞之后开始验证自噬探针是否可用，我们利用营养缺乏使细胞处于饥饿状态来诱导细胞发生自噬，实验中对照组细胞培养在正常的哺乳动物细 胞培养基中，诱导自噬的细胞用没有葡萄糖的培养基和 HHBSS 缓冲液分别培养。为了看到细胞自噬的变化，我们对细胞的营养饥饿做了不同时间长度的处理，分别为 1 小时、2 小时、4 小时和 8 小时，共聚焦显微镜拍摄的显微图片中，显示饥饿时间越长，细胞中只有红色荧光的斑点越多，也就是说细胞自噬的程度随着饥饿时间的加长而加剧。另外，我们通过显微镜放大拍摄，得到足以拍摄单个细胞并在细胞中看到红色和绿色的荧光斑点，分别对红色和绿色的荧光斑点数量进行统计和计算，发现红色和绿色的荧光斑点在发生自噬的细胞中都增加了，但是红色斑点的增加高于绿色的增加，这与之前的研究结果完全符合：表达后的 LC3 蛋白位于细胞核中，当细胞发生自噬的时候 LC3 从细胞核内转移到细胞质中去参与细胞自噬，因此，细胞发生自噬的时候细胞质中的 LC3 会增加，红色和绿色的荧光斑点也随着增加了。而正如我们之前所说，绿色荧光因为对溶酶体内的低 pH 敏感而不显色，所以绿色荧光的增加少于红色荧光的增加。我们实现实验目标的其中一个条件是要在细胞内引起一定频率的钙离子震荡，因此我们需要一个能反映钙离子浓度变化的指示物，在本研究中，我们选择 R-GECO 作为钙离子指示器。GECO 是通过遗传突变筛选得到的一系列能够定量反映细胞内钙离子浓度的指示物，有 G-GECO，B-GECO，R-GECO 等，他们分别对应不同波长的激发光和发射光，其中 R-GECO 能够被 560nm 的激光激发，发射光接近 600nm，这个红移的荧光指示物 R-GECO 相对于其它蓝移的GECO 来说，激发它所需要的波长更长的激发光对细胞产生的光毒性更低，而且这个波长的激光相对于蓝光和绿光来说其组织透过性也更好。在细胞中钙离子浓度低的时候，R-GECO 几乎处于没有和钙离子结合的状态，此时 R-GECO不能被 560nm 激光激发，检测不到荧光信号，当细胞内钙离子浓度增加后，R-GECO 与钙离子结合，使 R-GECO 能够被激光激发，增强的荧光信号也会被检测到。与此同时，我们需要一个能够调节钙离子浓度的光敏蛋白元件。内源的光敏感视网膜神经节细胞（ipRGCs）能够表达一种视黑素蛋白（OPN4），这个蛋白是 G 蛋白偶联受体的视蛋白中的一个亚型，蓝光（波长约 480nm）刺激能够调节 11-cis retinal(R)发色团从而改变人工合成的光遗传转录的 OPN4 的构象，随后依次激活 Gaq 型 G 蛋白、磷脂酶 C 和磷酸激酶 C,这一系列的激活反应最终激发膜上的瞬时受体电压通道（TRPCs），钙离子将通过 TRPCs 通道进入细胞质中，流入细胞中的钙离子可能来自于细胞外也可能来自于细胞内储存钙离子的细胞器，如内质网。我们根据文献提供的信息分别合成了 R-GECO 和 OPN4 对应的序列，通过分子生物学手段构建质粒并将这两个基因敲入到 Hela 细胞的基因组中，通过细胞系构建的方法得到稳定遗传的 Hela-R-GECO 和 Hela-R-GECO-OPN4 细胞系，并在这一细胞系上进行光调控追踪钙离子信号的实验，实验中我们通过调节蓝光的光强、光照的频率及每个周期光开启的时间，其中光强可通过显微镜软件上的控制面板手动调节白光光源强度，光照射细胞的时间由信号发生器输出的周期和占空比所调节，荧光信号的检测则是通过显微镜进行时间间隔序列拍摄，实验中我们构建了没有 OPN4 的细胞系 Hela-R-GECO 用作对照组，在相同的光强、周期和占空比的光照条件下，Hela-R-GECO-OPN4 细胞中产生的钙震荡信号大约是 Hela-R-GECO 的 11 倍，而且在 Hela-R-GECO-OPN4 细胞中的该信号也更规律。我们用不同的光强、不同的占空比和不同的周期交叉组合的条件去探索细胞内钙离子震荡的情况，最后发现 20%的占空比和 5s 及以上的周期能得到与光照频率一致的钙离子震荡信号，实验结果显示钙离子震荡的幅度与蓝光光强呈正相关，光强越强，钙离子震荡幅度越大。基于前面对细胞自噬探针和钙离子浓度变化指示器的验证都有效后，我们将能够调控钙离子震荡的 OPN4 和能反映细胞自噬的 LC3 结合，构建了一个新的细胞系 Hela-LC3-OPN4,这一细胞系在培养箱中用蓝光光照 16 个小时之后，通过流式细胞仪对细胞内的 LC3 所携带的 GFP 和 RFP 信号进行高通量检测分析。本实验中我们用了三种培养基培养细胞，包括普通哺乳动物细胞培养基、没有血清的培养基和 HHBSS 缓冲液，在每一种培养基培养的细胞中，我们检测了 12 组光照参数，在这 12 组参数中有一组是不加光照的对照组，一组加了长亮的平均光强（平均光强=实验组光强*占空比），有一组光照参数是在检测钙离子震荡信号实验中优化得到的，即 30mW 的光强、5 秒的周期和 80%的占空比，其余的光照参数光强为 30mW，但是周期和占空比不全部相同。对同一种培养基培养的细胞的高通量检测到的红色和绿色荧光分析发现，经过相同光强和占空比但不同周期的细胞中红色和绿色的荧光都高于不加光照的细胞，我们推测这是由于细胞自噬被抑制了从而使得细胞中的红色和绿色荧光蛋白没有因为自噬溶酶体的形成而被溶酶体酶降解。另外绿色除红色荧光得到的比例值也相应的高于不加光照的细胞，按照自噬探针 GFP-RFP-LC3 的原理，这一结果是因为经过蓝光光照的细胞中形成的自噬溶酶体减少，从而减少了其细胞中溶酶体酸性环境对绿色荧光蛋白的荧光淬灭，因此绿色对红色荧光的比例高于对照组细胞，这些结果表明经过一定频率的蓝光照射过的细胞中的细胞自噬被抑制了，也就是说钙离子震荡抑制了细胞自噬。

Autophagy Optogenetics Calcium dynamics

细胞自噬 光遗传学 钙离子震荡

英语

联合培养

南方科技大学

Chen Y. AUTOPHAGY AND CALCIUM DYNAMICS[D]. 深圳. 哈尔滨工业大学,2018.