CRISPR-Cas 系统是细菌和古细菌中广泛存在的一种适应性免疫系统，能够识别并切割外源遗传物质，如噬菌体 DNA 或 RNA。为了对抗这一免疫系统，噬菌体进化出了多种抗 CRISPR (anti-CRISPR) 系统。

近日，南方科技大学医学院生物化学系副教授贾宁团队与华盛顿大学教授 Alexander J. Meeske 团队合作，在学术顶级期刊 Science 发表了题为“RNA-mediated CRISPR-Cas13 inhibition via crRNA structural mimicry”的研究论文。研究揭示了一种新型内源的名为 rAcrVIA1 的小 RNA 分子，它通过模拟 crRNA 的结构来抑制 CRISPR-Cas13 系统的活性，从而帮助外源核酸逃避宿主的免疫防御。这类新型 RNA 抗 CRISPR分子（rAcrs）的发现为拓展了对 CRISPR 系统的调控机制的理解，为开发基于 RNA 的 CRISPR 精准调控工具提供了新的思路。

贾宁团队一直聚焦于原核生物（细菌和古菌）免疫防御系统抵御噬菌体和质粒入侵的分子机制研究，近几年来揭示了包括 CRISPR 及 pAgos 系统在内的多种原核生物免疫系统抵御噬菌体和质粒入侵的分子机制（Nature Chemical Biology, 2024; Molecular Cell, 2023, 2019a, 2019b, 2019c; Nature Communications, 2024a , 2024b, 2022; Science, 2020; Cell Research, 2024, 2022, 2020; Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2021等）。对于噬菌体反防御机制，目前报道的大多数 anti-CRISPR 系统属于蛋白类型，其余一些 RNA 类型的 anti-CRISPR 也与其 crRNA 有很高的序列相似性并通过取代 crRNA 发挥抑制作用。是否存在其它类型的 anti-CRISPR 系统，是否与 crRNA 没有序列相似性的其它 RNA 能起到抑制作用尚不清楚。

研究人员通过实验发现在一个已知 anti-CRISPR 蛋白上游存在一小段非编码序列可以直接抑制 CRISPR-Cas13 系统（图1），并用小 RNA 测序证实了这段序列可以转录成一段 37-60 nt 长度的非编码 RNA。RNA 结构预测这一序列可以形成两个颈环结构，进一步的突变实验表明这一 RNA 的二级结构对发挥抑制功能至关重要，并将其命名为 rAcrVIA1。

图1 一段小非编码RNA（rAcrVIA1）抑制六型CRISPR-Cas系统发挥活性

同时，研究人员通过共表达 Cas13 蛋白和 rAcrVIA1 并通过 pulldown 实验发现 Cas13 能够与 rAcrVIA1 形成稳定的复合物，而当对 Cas13 与 crRNA 成熟有关的关键残基进行突变后却不能形成复合物，这一结果表明 rAcrVIA1 和 crRNA 都是被 Cas13 以相似的方式进行加工成熟的。

研究人员通过冷冻电镜进一步解析了 Cas13-rAcrVIA1 复合物的整体结构后发现，尽管 rAcrVIA1 与 crRNA 并不存在序列相似性，但他们的整体结构非常相似（图2）。这意味着 rAcrVIA1 通过模拟 crRNA 结构的方式发挥抑制作用，rAcrVIA1 无法像 crRNA 一样进一步结合底物 RNA，所以结合 rAcrVIA1 后 Cas13 的 HEPN 活性位点始终处于距离较远的抑制状态。

图2 rAcrVIA1 和 crRNA 折叠成相似的整体结构

研究人员发现，rAcrVIA1 与另一种已知的 Cas13 抑制蛋白 AcrVIA2 共同存在于一个基因簇中，但它们通过不同的机制协同发挥抑制作用。rAcrVIA1主要通过结构模拟并竞争性抑制 Cas13 与 crRNA 的结合从而影响其活性，而 AcrVIA2 则通过降解 crRNA 来抑制 Cas13 系统。这种协同的双重抑制机制可能为外源基因片段入侵宿主时提供了更强的免疫逃逸能力。

此外，rAcrVIA1 的表达还受到上游基因 ORF1 的调控。ORF1 是一个具有螺旋-转角-螺旋（HTH）结构域的蛋白质，能通过自抑制机制调控 rAcrVIA1 的转录。当 ORF1 缺失时，rAcrVIA1 的表达受到抑制，导致其无法有效抑制 Cas13。这一发现揭示了 rAcrVIA1 在自然条件下的精细调控机制。

综上，该研究不仅揭示了 RNA 抗 CRISPR 分子的新机制，还为未来开发基于 RNA 的 CRISPR 调控工具提供了新的思路。通过模拟 crRNA 的结构，rAcrVIA1 能够有效地抑制 Cas13 的活性，这为设计更加精准的基因编辑工具提供了新的可能性。

南方科技大学医学院生物化学系张峻涛和华盛顿大学微生物系 Victoria M. Hayes 为本论文的共同第一作者，贾宁和 Alexander J. Meeske 为本论文的共同通讯作者。该研究得到了中国国家自然科学基金、广东省重点实验室等项目、广东省和深圳市面上自然基金、深圳市孔雀计划的大力支持。南方科技大学冷冻电镜中心为该研究相关的冷冻电镜数据收集和处理工作提供了大力支持。

论文链接：http://doi.org/10.1126/science.adr3656

供稿：生物化学系

通讯员：杨玲

主图：丘妍

编辑：曾昱雯